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    詳細信息

    新品推薦:動物細胞/組織活性線粒體分離試劑盒

     主要用途

     

    動物細胞/組織活性線粒體分離試劑是一種旨在從動物細胞或組織中分離出完整而純化的活性線粒體細胞器的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。適合于動物軟組織(肝或腦組織)和培養細胞的活性線粒體的制備。其制備物產量高,活性保證,可以被用于線粒體酶活性、細胞凋亡、信號傳遞、代謝和蛋白組學等的研究。產品不含污染性蛋白水解酶和核酶,即到即用,性能穩定,分離產量和純度高。

     

    技術背景

     

    線粒體細胞器的分離是現代細胞生物學研究的最常用的手段之一。從任何組織或細胞分離線粒體的技術方法基本上采用:第一,通過機械或化學方法破裂細胞;第二,通過低速差速離心去除殘渣碎屑和巨大細胞器;第三,通過高速差速離心獲得線粒體;甚至,第四,可以通過等密度離心獲得純度更高的線粒體。 

     

    產品內容

     

    清理液(Reagent A   100毫升

    裂解液(Reagent B    40毫升

    凈化液(Reagent C    10毫升

    強化液(Reagent D     5毫升

    保存液(Reagent E   100毫升

    活性液(Reagent F   200微升

    產品說明書 1

     

    保存方式

     

    保存凈化液(Reagent C)和活性液(Reagent F)在-20冰箱里;其余的保存在4冰箱里,有效保證6

     

    用戶自備

     

    HANK平衡鹽緩沖溶液(12028)或PBS緩沖溶液(12033):用于清理細胞

    胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液(12024):用于細胞脫離

    完全細胞培養液(12052):用于中和胰蛋白酶的細胞培養基

    15毫升錐形離心管:用于線粒體初步制備物的存放

    50毫升錐形離心管:用于細胞或組織收集后離心或清洗

    1.5毫升離心管:用于保存線粒體

    4℃臺式離心機:用于沉淀細胞

    4℃超速離心機:用于分離細胞器成分

    DOUNCE勻漿器:用于裂解細胞

    實驗步驟

     

    一、動物軟組織線粒體分離(組織勻漿法)

     

    實驗開始前,將試劑盒里的凈化液(Reagent C活性液(Reagent F凍融,然后移出20微升活性液(Reagent F、1毫升凈化液(Reagent C4毫升的裂解液(Reagent B15毫升錐形離心管里,混勻后,標記為裂解工作液,放進冰槽里備用。然后進行下列操作。

     

    1. 手術取出動物組織,并秤重以確定組織重量(注意:實驗前最好使動物空腹1224小時

    2. (選擇步驟)放進預冷的50毫升錐形離心管

    3. (選擇步驟)加入適量的(1克組織需要5毫升)清理液(Reagent A清洗1

    4. 即刻用刀片切碎組織

    5. 放進一個預冷的15毫升錐形離心管

    6. 加入預冷的5毫升裂解工作液

    7. 渦旋震蕩5秒,充分混勻

    8. 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器,在冰槽里用勻漿棒勻化組織(約2040下)(注意:參見注意事項8

    9. 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管

    10. 放進4臺式離心機離心10分鐘,速度為1500g

    11. 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞

    12. 放進4超速離心機離心10分鐘,速度為10000g

    13. 小心抽去上清液,保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物

    14. (選擇步驟)加入預冷的3毫升保存液(Reagent E

    15. (選擇步驟)放進4超速離心機再次離心5分鐘,速度為10000g

    16. (選擇步驟)小心抽去上清液

    17. 加入1毫升保存液(Reagent E,充分混勻

    18. 即刻移入1.5毫升離心管,放進-70冰箱里

     

    二、動物軟組織線粒體分離(化學處理法)

     

    實驗開始前,將試劑盒里的凈化液(Reagent C活性液(Reagent F凍融,然后移出20微升活性液(Reagent F、1毫升凈化液(Reagent C4毫升的裂解液(Reagent B15毫升錐形離心管里,混勻后,標記為裂解工作液,放進冰槽里備用。然后進行下列操作。

     

    1. 手術取出動物組織,并秤重以確定組織重量(注意:實驗前最好使動物空腹1224小時

    2. (選擇步驟)放進預冷的50毫升錐形離心管

    3. (選擇步驟)加入適量的(1克組織需要5毫升)清理液(Reagent A清洗1

    4. 移入一個液氮凍存管

    5. 即刻放進液氮罐過夜

    6. 次日從液氮罐里取出,即刻(最快速度)碾碎組織(注意:切莫使組織凍融

    7. 放進一個15毫升錐形離心管

    8. 加入預冷的5毫升裂解工作液

    9. 渦旋震蕩5秒,充分混勻

    10. 在冰槽里孵育2分鐘,其中每間隔一分鐘渦旋震蕩5

    11. 加入預冷的500微升強化液Reagent D

    12. 渦旋震蕩5秒,充分混勻

    13. 在冰槽里孵育5分鐘,其中每間隔一分鐘渦旋震蕩5(注意:參見注意事項9

    14. 加入預冷的5毫升保存液(Reagent E,用手混勻

    15. 放進4臺式離心機離心10分鐘,速度為1500g

    16. 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞

    17. 放進4超速離心機離心10分鐘,速度為10000g

    18. 小心抽去上清液,保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物

    19. (選擇步驟)加入預冷的3毫升保存液(Reagent E

    20. (選擇步驟)放進4超速離心機再次離心5分鐘,速度為10000g

    21. (選擇步驟)小心抽去上清液

    22. 加入1毫升保存液(Reagent E,充分混勻

    23. 即刻移入1.5毫升離心管,放進-70冰箱里

     

    三、動物細胞線粒體分離(細胞勻漿法)

     

    實驗開始前,將試劑盒里的凈化液(Reagent C活性液(Reagent F凍融,然后移出20微升活性液(Reagent F、1毫升凈化液(Reagent C4毫升的裂解液(Reagent B15毫升錐形離心管里,混勻后,標記為裂解工作液,放進冰槽里備用。然后進行下列操作。

     

    1. 準備51075cm2細胞培養瓶的細胞(5 X 107),直至細胞生長鋪滿整個培養表面

    2. 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細胞培養瓶,覆蓋培養瓶表面,

    3. 小心抽去清洗液

    4. 重復實驗步驟23一次

    5. 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液,鋪滿整個培養平面

    6. 放進37培養箱孵育3分種

    7. 手擊震動培養瓶,使細胞脫落

    8. 分別加入10毫升用戶自備的完全細胞培養液

    9. 全部移入到一個50毫升錐形離心管

    10. 放進臺式離心機離心10分鐘,速度為200g

    11. 小心抽去上清液

    12. 加入10毫升預冷的清理液(Reagent A),混勻細胞

    13. 放進臺式離心機離心10分鐘,速度為300g

    14. 小心抽去上清液

    15. 加入預冷的5毫升裂解工作液

    16. 渦旋震蕩5秒,充分混勻細胞顆粒群

    17. 即刻放進預冷的DOUNCE勻漿器,在冰槽里用勻漿棒勻化細胞(約2040下)(注意:參見注意事項8

    18. 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管

    19. 放進4臺式離心機離心10分鐘,速度為1500g

    20. 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞

    21. 放進4超速離心機離心10分鐘,速度為10000g

    22. 小心抽去上清液,保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物

    23. (選擇步驟)加入預冷的3毫升保存液(Reagent E

    24. (選擇步驟)放進4超速離心機再次離心5分鐘,速度為10000g

    25. (選擇步驟)小心抽去上清液

    26. 加入1毫升保存液(Reagent E,充分混勻

    27. 即刻移入1.5毫升離心管,放進-70冰箱里

     

    四、動物細胞線粒體分離(化學處理法)

     

    實驗開始前,將試劑盒里的凈化液(Reagent C活性液(Reagent F凍融,然后移出20微升活性液(Reagent F、1毫升凈化液(Reagent C4毫升的裂解液(Reagent B15毫升錐形離心管里,混勻后,標記為裂解工作液,放進冰槽里備用。然后進行下列操作。

     

    1. 準備51075cm2細胞培養瓶的細胞(5 X 107),直至細胞生長鋪滿整個培養表面

    2. 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽溶液或PBS溶液到每個細胞培養瓶,覆蓋培養瓶表面

    3. 小心抽去清洗液

    4. 重復實驗步驟23一次

    5. 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液,鋪滿整個培養平面

    6. 放進37培養箱孵育3分種

    7. 手擊震動培養瓶,使細胞脫落

    8. 分別加入10毫升用戶自備的完全細胞培養液

    9. 全部移入到一個50毫升錐形離心管

    10. 放進臺式離心機離心10分鐘,速度為200g

    11. 小心抽去上清液

    12. 加入10毫升預冷的清理液(Reagent A

    13. 放進臺式離心機離心10分鐘,速度為300g

    14. 小心抽去上清液

    15. 加入預冷的5毫升裂解工作液

    16. 渦旋震蕩5秒,充分混勻

    17. 在冰槽里孵育2分鐘,其中每間隔一分鐘渦旋震蕩5

    18. 加入預冷的500微升強化液Reagent D

    19. 渦旋震蕩5秒,充分混勻

    20. 在冰槽里孵育5分鐘,其中每間隔一分鐘渦旋震蕩5(注意:參見注意事項9

    21. 加入預冷的5毫升保存液(Reagent E,用手混勻

    22. 放進4臺式離心機離心10分鐘,速度為1500g

    23. 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞

    24. 放進4超速離心機離心10分鐘,速度為10000g

    25. 小心抽去上清液,保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物

    26. (選擇步驟)加入預冷的3毫升保存液(Reagent E

    27. (選擇步驟)放進4超速離心機再次離心5分鐘,速度為10000g

    28. (選擇步驟)小心抽去上清液

    29. 加入1毫升保存液(Reagent E,充分混勻

    30. 即刻移入1.5毫升離心管,放進-70冰箱里

     

    注意事項

     

    1. 本產品為10次(1克動物組織或5 X 107細胞)或50次(200毫克動物組織或1 X 107細胞)操作

    2. 實際操作的動物組織重量或細胞量與試劑使用量按比例調整:例如200毫克動物組織:試劑用量是標準用量的五分之一

    3. 所有操作均須在4或以下狀態進行

    4. 操作時,須戴手套

    5. 操作時,須無菌操作,避免污染母液,尤其是裂解液(Reagent B保存液(Reagent E

    6. 建議使用足夠的樣品量

    7. 建議嚴格控制操作時間

    8. 通常勻化次數為2040下(或細胞顆粒群/組織塊狀消失為止)達到80%的細胞裂解為理想狀態,但不同的組織或細胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細胞裂解程度:完整細胞呈現發亮的圓環。低于50%可以增加勻化次數

    9. 通常孵育5分鐘(不宜超過5分鐘)達到80%的細胞裂解為理想狀態,但不同的組織或細胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升裂解物的細胞裂解程度:完整細胞呈現發亮的圓環。低于50%可以增加孵育時間和渦旋震蕩次數

    10. 對于難以裂解的細胞,例如HeLa細胞,采用物理勻漿法是優先推薦的技術處理

    11. 通常5 X 107細胞或1克動物組織的線粒體含量為50微克以上線粒體蛋白

    12. 如果需要計量線粒體,稀釋后數分鐘內完成,否則線粒體將分解

    13. 本產品所獲得的線粒體純度和產量最為理想。通過調整10000g離心速度到30008000g,可以提高粗提的線粒體純化程度,但線粒體產量相應減少

    14. 如果需要獲得99%以上純度的線粒體,使用動物細胞/組織高質純化線粒體分離試劑盒10006.3

    15. 線粒體正?;钚詼y定方法是: CITRATE SYNTHASE活性、氧化磷酸化、細胞色素吸收峰譜等

    16. 線粒體內外膜完整測定方法是:CYTOCHROME C OXIDASE活性和熒光JC染色

    17. 本公司提供線粒體套餐:ROS、NAO、MitoTRACK、JGB、線粒體溶解等

    18. 本公司提供系列線粒體分析試劑產品

     

    質量標準

     

    1. 本產品經鑒定性能穩定

    2. 本產品經鑒定分離的線粒體內外膜完整

    3. 本產品經鑒定分離的線粒體維持正?;钚?/font>

    4. 本產品經鑒定不含污染性蛋白酶和核酶

     

    使用承諾

     

    本公司秉著信譽至上、客戶滿意、質量承諾的宗旨為我們的用戶提供優質產品和服務。用戶收到貨后,應按照產品說明書上的規定妥善保管并在有效期內使用。我們的產品在銷售前已作嚴格的質量鑒定,保證說明書所述的使用效果。在貨到后10天內若發現確屬本產品的質量問題,請立即以書面形式(實驗報告)與本公司聯系,并將該產品退回,經檢驗確系產品質量所致,本公司負責更換產品。如系使用者錯誤操作所致,本公司不承擔由此造成的損失。

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