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    詳細信息

    【免疫平臺】免疫共沉淀(Co-IP)

      實驗原理

    免疫共沉淀( Co-Immunoprecipitation)是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法。是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。當細胞在非變性條件下被裂解時,完整細胞內存在的許多蛋白質-蛋白質間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質 X 的抗體免疫沉淀 X,那么與 X 在體內結合的蛋白質 Y 也能沉淀下來。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質是否在體內結合;也可用于確定一種特定蛋白質的新的作用搭檔。

    免疫共沉淀的優缺點

    優點:
    (1)相互作用的蛋白質都是經翻譯后修飾的,處于天然狀態;
    (2)蛋白的相互作用是在自然狀態下進行的,可以避免人為的影響;
    (3)可以鑒定一種特定蛋白質的作用搭檔;
    (4)可以分離得到天然狀態的相互作用蛋白復合物。
    缺點:
    (1)可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質-蛋白質相互作用;
    (2)兩種蛋白質的結合可能不是直接結合,而可能有第三者在中間起橋梁作用;
    (3)必須在實驗前預測目的蛋白是什么,以選擇最后檢測的抗體,所以,若預測不正確,實驗就得不到結果,方法本身具有冒險性。


    實驗流程

    (1)收集新鮮的細胞懸液,用PBS洗滌細胞2次,4℃、1000 rpm離心5-10 min收集細胞;
    (2)加入適量細胞裂解液(含蛋白酶抑制劑),徹底將細胞沉淀分散并懸浮,冰上裂解30 min,4℃、12000 rpm離心10-15 min收集上清;
    (3)將上清轉移到一新的離心管中,以備蛋白濃度測定及后續實驗;
    (4)測定細胞裂解液(收集上清)中蛋白總濃度;
    (5)取一離心管,加入適量的上清液和相應的抗體(適當比例),混勻。在4°C緩慢振蕩孵育過夜,以形成免疫復合物;
    (6)取適量protein A或protein G或protein A/G 瓊脂糖磁珠,用適量裂解緩沖液洗3次,每次3000 rpm離心3 min;
    (7)將預處理過的瓊脂糖磁珠加入到盛有抗原抗體復合物的離心管中,4°C 緩慢振蕩孵育
    2-4 h,使抗體與瓊脂糖磁珠偶聯;
    (8)免疫沉淀反應后,4°C、3000 rpm 離心 5-10 min,將瓊脂糖磁珠離心至管底,除去未結合的樣品,保存以備分析;
    (9)向離心管中加入適量的裂解緩沖液洗 3-4 次,離心收集磁珠棄上清;
    (10)向離心管中加入適量電泳上樣緩沖液,沸水煮 5 分鐘,保留含有抗原的上清;
    (11)取部分用于SDS-PAGE分析,余下置于-20℃保存。


    注意的問題
    (1)細胞裂解采用溫和的裂解條件,不能破壞細胞內存在的所有蛋白質-蛋白質相互作用,多采用非離子變性劑(NP40或Triton X-100)。每種細胞的裂解條件是不一樣的,通過經驗確定。不能用高濃度的變性劑(0.2%SDS),細胞裂解液中要加各種酶抑制劑;
    (2)使用明確的抗體,可以將幾種抗體共同使用;
    (3)可以選擇使用對照抗體,如單克隆抗體:正常小鼠的 IgG 或另一類單抗;兔多克隆抗體:正常兔 IgG;
    (4)為確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的,而并非外源非特異蛋白,單克隆抗體的使用有助于避免污染的發生;
    (5)要確??贵w的特異性,即在不表達抗原的細胞溶解物中添加抗體后不會引起共沉淀;
    (6)確定蛋白間的相互作用是發生在細胞中,而不是由于細胞的溶解才發生的,這需要進行蛋白質的定位來確定。

    實驗周期與費用

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